DNA-Labor
Inhaltsverzeichnis
- Methoden zur effizienten Bearbeitung vom Mischspuren
- Gewebedifferenzierung mittels Micro-RNAs im forensisch / anthropologischen Kontext
- Pharmakogenetik
- Poster - DNA Analyse
Neue Methoden zur effizienten Bearbeitung vom Mischspuren
Problemstellung
Individualisierende Untersuchungen, zum Zwecke der Zuordnungen von am Tatort aufgefundenem Spurenmaterial zu einzelnen Personen, werden in der modernen Forensik fast ausschließlich durch Analysen hochvariabler Längenploymorphismen, den so genannten short tandem repeats (STR's), durchgeführt. Bedingt durch das hohe Diskriminierungspotential dieser Marker, ist bei Untersuchung mehrerer Loci eine zweifelsfreie Zuordnung einer Spur zu einer Person möglich.
Die Untersuchung von Mischspuren, also Spuren biologischen Materials von mehr als einer Person, stellt eine besondere Herausforderung dar. Sie führt in der Regel zu einem Mischprofil, d.h. die Merkmale aller an einer Mischung beteiligten Personen werden dargestellt. Nur in Ausnahmefällen - zum Beispiel bei Fällen mit deutlich erkennbarer Hauptkomponente - ist es möglich, den Genotyp einer einzelnen an der Mischung beteiligten Person abzuleiten. Die Rekonstruktion einzelner Genotypen hat einen entscheidenden Einfluss auf die abschließende biostatistische Beurteilung und somit die Aussagekraft der Ergebnisse. Darüber hinaus ist ein Abgleich des Identifizierungsmusters einer bisher nicht zugeordneten Tatortspur mit nationalen oder internationalen DNA-Datenbanken, zum Zwecke der Täterermittlung mit Mischprofilen, nicht möglich.
Ebenfalls problematisch ist die Bearbeitung von Mischspuren mit extrem unterschiedlichen Anteilen der einzelnen Komponenten. Bei Mischungen, in denen der Anteil biologischen Materials einer beteiligten Person weniger als 2-5% beträgt, ist die Erstellung eines Identifizierungsmusters für diese Minorkomponente nicht mehr möglich. Oft zeigen aber gerade tatrelevante Spuren, wie abgeriebene, fremde Epithelzellen an Würgemalen, Halteverletzungen des Opfers oder Spuren von Ejakulat nach Vergewaltigung durch einen vasektomierten Täter, ein solch ungünstiges Mischungsverhältnis. Grundsätzlich können die zellulären Komponenten einer Mischung gleich sein, wie beispielsweise bei Blut-/Blutmischungen an Tatorten mit mehreren Verletzten, sie können sich jedoch auch - wie im Falle von Sperma-/Vaginalzellmischungen - morphologisch unterscheiden.nach oben
Lösungsansätze
Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Verfahren für eine effizientere Analyse von Mischspuren. Ziel ist die erfolgreiche Genotypisierung von Minorkomponenten mit einem Anteil von weniger als 5%. Dazu wurden in den letzten Jahren mehrere, methodisch unterschiedliche, Ansätze getestet bzw. neu entwickelt. Beispielsweise die Verwendung Y-chromosomaler Marker zur besseren Darstellung eines männlichen Genotyps in einer Mischung aus weiblichen und männlichen Zellen (Anslinger et al., 2000). Darüber hinaus konnten nach Hybridisierungen mit verschiedenen Y- oder X-/Y-spezifischen Sonden (Abb. 1 und 2) je nach Fragestellung gezielt männliche bzw. weibliche und morphologisch nicht differenzierbarer Zellen einer Mischungen markiert werden (Anslinger et al., 2005, Anslinger et al., 2005 und Anslinger et al., 2007). Die Isolierung eindeutig markierter Zellen erfolgte im Anschluß mittels Lasermikrodissektion (LMD, Abb. 3). Diese Technik ermöglicht die Separation von im mikroskopischen Präparat sichtbaren Einzelzellen oder kleineren Zellverbänden. Diese werden entweder durch einen Laserimpuls angeregt in ein Reaktionsgefäß katapultiert oder aus dem Präparat ausgeschnitten und über Adhäsionsfolien an den Deckel eines Reaktionsgefäßes gebunden. Auf Grund der entwickelten Technik konnten vollständige Profile einzelner Personen aus verschiedensten Zellmischungen erhalten werden. Darüber konnte im Zusammenspiel mit optimierten DNA-Extraktions- und Genotypisierungsprotokollen, auch die für die Erstellung eines Einzelprofils benötigte Zellmenge stark reduziert und die Sensitivität somit merklich erhöht werden.
Abb. 2: Hybridisierung einer männlichen Zelle mit einer X-/Y-spezifischen Sonde. Das X-Chromosom ist rot, das Y-Chromosom grün markiert
Abb. 3: Lasermikrodissektion (LMD) – Der Laser schneidet die Folie um die Zelle
Abb. 5: Immunhistochemische Färbung einer Spermatozoe mit monoklonalen tACE-Antikörpern
Publikationen
- Anslinger K, Keil W, Weichhold G, Eisenmenger W (2000) Y-chromosomal STR haplotypes in a population sample from Bavaria. Int J Legal Med 113: 189-192
- Anslinger K, Mack B, Bayer B, Rolf B, Eisenmenger W (2005) Digoxigenin labelling and laser capture microdissection of male cells. Int J Legal Med 119: 374-377
- Anslinger K, Mack B, Bayer B, Rolf B (2006) Fluorescence labelling and isolation of male cells. In: Progress in Forensic Genetics 11, Elsevier Verlag, ISBN 0 444 52102 X
- Anslinger K, Mack B, Bayer B, Eisenmenger W (2007) Sex-specific fluorescent labelling of cells for laser microdissection and DNA profiling. Int J Legal Med 121: 54-56
- Anslinger K, Bayer B, Danilov S, Metzger R (2008) Application of sperm specific antibodies for the separation of sperm from cell mixtures. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1 (2008), pp. 394-395
Gewebedifferenzierung mittels Micro-RNAs im forensisch / anthropologischen Kontext
Ziel des Forschungsprojektes ist es, die für die Rechtsmedizin relevanten Gewebe- bzw. Zellarten wie Blut, Menstrualblut, Haut, Speichel, Sperma, Analepithel oder Vaginalsekret hochspezifisch zu identifizieren. Neben der Zuordnung einer Spur zu einer Person mit Hilfe des so genannten genetischen Fingerabdrucks (Identifizierungsmusters) stellt sich häufig auch die Frage, aus was für einer Art von Zellen die Spur besteht. Vor allem bei Sexualdelikten ist es für das Gericht zur Urteilsfindung oftmals relevant, ob sich beispielsweise am Penisabstrich des Tatverdächtigen Schiedenzellen (Vaginalverkehr) oder aber Mundschleimhautzellen (Oralverkehr) oder ggf. nur Hautepithelzellen (Kontaktspur) des Opfers befinden. Auch die Unterscheidung zwischen Menstrual- und peripherem Blut, welches durch eine Verletzung entstanden ist, kann in Einzelfall von entscheidender Bedeutung sein.
Für viele Zell- bzw. Körperflüssigkeiten existieren bereits Vortests, welche jedoch häufig relativ viel Zellmaterial benötigen. Dagegen ist z. B. die Unterscheidung von Menstrualblut und peripheren Blut oder die Differenzierung von Mundschleimhaut- bzw. Vaginalschleimhautzellen mit den routinemäßig angewandeten Vortests nicht oder nicht mit ausreichender Sicherheit möglich.
In diesem Projekt soll ein neues Nachweisverfahren entwickelt werden, welches basierend auf dem Nachweis von mirko-RNAs in der Lage sein soll, sämtliche Epithel- und Sekrettypen mit einem einzigen Vortest hochspezifisch zu unterscheiden. Mikro-RNAs sind ca. 20 Basen lange Nukleinsäuren, die nach neuen Erkenntnissen eine erhebliche Rolle bei der Regulation vieler Gene spielen. Da die Regulation bestimmter mirko-RNAs bzw. deren Expression streng gewebespezifisch ist, soll mit Hilfe von noch zu ermittelnden Markern die Quantität der mikro-RNAs gemessen um damit ein Rückschluss auf die untersuchte Gewebeart erhalten zu können. Erste Ergebnisse einer Master-Arbeit über die Durchführbarkeit des Projektes verliefen äußerst positiv.nach oben
Pharmakogenetik
Pharmakogenetik beschäftigt sich in erster Linie mit dem Einfluss individueller genetischer Unterschiede auf die Wirkung einzelner Medikamente. Meist wird bei einer medikamentösen Behandlung die gewünschte Arzneimittelwirkung erreicht, jedoch kommt es in Ausnahmefällen dazu, dass kein therapeutischer Effekt eintritt oder, dass unerwünschte Nebenwirkungen auftreten. Die Effizienz einer medikamentösen Behandlung und die Wahrscheinlichkeit einer negativen Reaktion kann neben dem Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten, die zu behandelnde Krankheit und Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten ebenfalls durch genetische Faktoren beeinflusst werden. Durch die Untersuchung genetischer Variationen bei Proteinen, insbesondere Enzymen, die mit Arzneimittelwirkstoffen interagieren bzw. am Metabolismus von Medikamenten beteiligt sind, erhofft man sich einen besseren Einblick in die interindividuellen Unterschiede bei medikamentösen Behandlungen zu bekommen und bereits im Vorfeld die Wahl des Arzneimittelwirkstoffes und dessen Dosierung über eine Bestimmung des Genprofils des zu behandelnden Patienten zu optimieren. In diesem Zusammenhang wurden hier am Institut für Rechtsmedizin der Universität München schon mehrere Studien durchgeführt. Zum Beispiel wurde der Einfluss des Cytochrom P 450 Enzyms CYP2D6 auf den Metabolismus von Methadon, der Zusammenhang zwischen Mutationen im NAT 2 Gen und der Verstoffwechslung von Isoniazid bzw. die Auswirkungen von Polymorphismen in den Genen für CYP2D6 und CYP2C19 auf den Metabolismus von Amitriptylin untersucht.
Methadon zeigt eine sehr ausgeprägte interindividuelle Variabilität in der Pharmakokinetik. Die Behandlung mit diesem Medikament muss auf jeden Patienten individuell abgestimmt werden, insbesondere im Hinblick auf die Dosierung und die Wahl der verabreichten Komedikation. Von besonderem Interesse ist diesbezüglich der Metabolismus und insbesondere Variationen in der Aktivität der Methadon abbauenden Cytochrom P450 Enzyme. Eines dieser Enzyme ist CYP2D6. Das Gen für CYP2D6 ist hoch polymorph. Man kann bezüglich der Enzymaktivität von CYP2D6 zwischen vier Hauptphänotypen unterscheiden: Die „Poor Metabolizer“ (PM) haben keine oder nahezu keine Enzymaktivität, „Intermediate Metabolizer“ (IM) eine verringerte Aktivität, „Extensive Metabolizer“ (EM) eine normale und „Ultra Rapid Metabolizer“ (UM) eine erhöhte Enzymaktivität. Bei einer Studie sollte festgestellt werden, in wie weit die häufigsten Polymorphismen im Gen für CYP2D6 den Metabolismus von Methadon beeinflussen. Hierbei konnte jedoch keine offensichtliche Korrelation zwischen den untersuchten Polymorphismen im CYP2D6 Gen und dem Abbau von Methadon festgestellt werden.
Amitriptylin, ein trizyklische Antidepressivum wird in der Leber hauptsächlich durch CYP2C19 demethyliert und vermutlich durch CYP2D6 hydroxiliert. Das Gen für CYP2C19 zeigt genau wie CYP2D6 Polymorphismen, die dessen Aktivität beeinflussen. Im Rahmen einer Fallstudie konnte ein Vergleich zwischen dem Verhältnis von Amitriptylin, Nortriptylin und dessen Hydroxylmetaboliten in Haaren und dem Genotyp von CYP2C19 bzw. CYP2D6 angestellt werden. Dabei zeigte sich, dass die Menge an Nortriptylin (relativ zur Menge an Amitriptylin) mit dem Genotyp von CYP2C19 stark korreliert. Darüber hinaus konnte auch eine signifikante Korrelation zwischen dem CYP2C19 Genotyp und der Bildung der Hydroxylmetabolite festgestellt werden. Eine offensichtliche Korrelation zwischen dem CYP2D6 Genotyp und der Hydroxylierung von Amitriptylin konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Isoniazid ist ein Antibiotikum und wird vor allem in Kombination mit Rifampicin zur Behandlung der Tuberkulose angewendet. Eines der am Metabolismus von Isoniazid beteiligten Enzyme ist die N-Acetyltransferase 2 (NAT2). Polymorphismen im Gen für NAT2 bedingen zum Teil individuelle Variationen der Aktivität dieses Enzyms. Man unterscheidet im Hinblick auf die Enzymaktivität von NAT2 zwischen drei Phänotypen: Die „slow acetylators“ haben eine verringerte Enzymaktivität, „intermediate acetylators“ eine mittlere Aktivität, „rapid acetylators“ eine normale, bzw. hohe Enzymaktivität. Eine durchgeführte Fallstudie, bei der das Verhältnis von Isoniazid zu Acetylisoniazid in Haaren mit dem Genotyp von NAT2 in Korrelation gesetzt wurde, konnte ein signifikanter Unterschied zwischen dem „slow acetylator“ Phänotyp und den beiden anderen Phänotypen festgestellt werden. Jedoch ergab sich zwischen den „intermediate acetylator“ und „rapid acetylator“ Phänotypen keine deutliche Abweichung im Abbau von Isoniazid.nach oben
Poster
Sie können sich auch ein Poster anschauen: Poster - DNA Analyse (1 MByte)
